Маркеры т киллеров

NK-клетки — Основы иммунологии (Ярилин)



NK-клетки (естественные киллеры)

В периферическом пуле лимфоцитов присутствует фракция клеток, лишенных маркеров Т- и В-лимфоцитов, обозначаемая как 0-клетки. Величина этой фракции оценивается по-разному в зависимости от чувствительности используемых методов.

Оглавление:

Доля Ig-СD3-лимфоцитов в крови и периферических лимфоидных органах составляет около 10—15 % от общего числа лимфоцитов. Эта фракция гетерогенна. В ее состав входят небольшое число незрелых лимфоидных предшественников, неидентифицированные лимфоциты, однако большую часть их составляют NK-клетки (от англ. natural killer), или естественные киллеры.

Основное свойство, обусловившее название этих клеток, состоит в том, что они способны лизировать определенные клетки-мишени без предварительного контакта и развития реакции типа иммунного ответа. Свойства естественных киллеров могут проявлять Т- и В-лимфоциты, а также макрофаги. Однако лишь NK-клетки представляют собой специализированные естественные киллеры. Они идентифицируются морфологически как большие гранулярные лимфоциты. Их содержание в крови составляет 5—20 % от общего числа лимфоцитов. По размеру они соответствуют большим лимфоцитам (12—15 мкм в диаметре при 7—9 мкм для малых лимфоцитов). Плотность (1,062—1,064) NK-клеток ниже, чем у большинства лимфоцитов, что используется для выделения этих клеток в градиенте перколла. Гранулы больших гранулярных лимфоцитов содержат перфорин — белок, обусловливающий образование пор в мембране клеток-мишеней, а также сериновые эстеразы — гранзимы, обусловливающие индукцию апоптоза при проникновении в клетки-мишени (см. раздел 2.2), и хондроитинсульфат А, защищающий NK-клетки от аутолиза.

Таблица 10. Мембранные маркеры NK-клеток



Мол. масса, x1000

Маркеры, причастные к распознаванию и NK цитолизу

CD161 (NKRP-1) NK1.1

Ингибиторные рецепторы киллеров (KIR)

Прочие мембранные молекулы

CD48, 69, 122 (β-цепь ИЛ-2- рецептора)



Маркерами естественных киллеров (см. рис. 8; табл. 10) служат анти гены CD56 и 57; CD56 представляет собой изоформу адгезивной молекулы N-CAM. Субфракцию К-клеток (т.е. клеток, осуществляющих зависимый от антител клеточный цитолиз — лизис клеток, опсонизированны антителами) маркирует молекула CD 16, являющаяся низкоаффинным рецептором IgG — FcγRIII, способным связывать агрегированные IgGl и IgG; Очевидна связь этого рецептора с функцией К-клеток. Определение с по мощью указанных маркеров содержания NK-клеток в популяциях лимфоцитов различных органов показало их высокий уровень в печени (42 %), селезенке (36 %) при низком содержании в лимфатических узлах (3 %), легких (5 %), тонкой кишке (3 %), костном мозгу (2 %); по этим данным, крови на долю NK-клеток приходится 12 % от общего числа лимфоцитов.

Кроме названных маркеров, на NK-клетках определяются адгезивные молекулы, в том числе интегрины и их рецепторы. Преобладание адгезивных молекул среди маркеров естественных киллеров не случайно оно отражает важность межклеточных контактов для осуществления цитолиза. Среди маркеров этих лимфоцитов необходимо упомянуть также ганглиозид acиалoGMl, а у мышей — антиген Thy-1.

Участие NK-клеток в иммунной защите будет рассмотрено в раздел 2.2; здесь мы приведем лишь самые общие сведения. Мишенями естественных киллеров служат разного рода трансформированные (инфицированные вирусом, опухолевые) и быстро пролиферирующие (например, кроветворные) клетки. При тестировании активности NK-клеток in vitro в качестве мишеней используют ограниченное число культивируемых клеточных линий, чаще других — клетки эритромиелолейкоза человека К562 и клетки лимфомы мыши YAC-1. Природа рецепторов, распознающих клетки-мишени естественных киллеров, начала раскрываться совсем недавно. Описана группа молекул, обладающих лектиноподобной распознающей способностью, к которой относятся высокомолекулярный гликопротеин NKR.1P(CD161), а также так называемые KAR-рецепторы (от англ, killer activation receptor).

Недавно установлена природа рецепторов, подавляющих цитолитическую активность NK-клеток в случае распознавания ими аутологичных молекул МНС I класса на клетках-мишенях. Ими оказались мембранные рецепторы, по структуре родственные иммуноглобулину, — NKB1, который распознает молекулы HLA-B, имеет 4 Ig-подобных внеклеточных домена, и два белка р58 — р58.1 и р58.2 (CD158a и b), имеющие по два Ig-подобных домена и распознающие HLA-C. У мышей ту же функцию выполняют молекулы семейства Ly49. Эта группа рецепторов получила наименование KIR (от англ, killer inhibitory receptor). Они вариабельны и формируют индивидуальную распознающую способность клетки, что дает основание говорить о клональной структуре NK-клеток.

Генез естественных киллеров изучен фрагментарно. Не вызывает сомнений, что их предшественники происходят от стволовой кроветворной клетки. Несмотря на определенные черты близости NK-клеток к миелоидному ряду, а также В-лимфоцитам, преобладает представление о том, что NK-лимфоциты являются ответвлением Т-клеточного ряда развития лимфоцитов. Об этом свидетельствуют наличие общих маркеров, роcтстимулирующих факторов, присутствие предшественников NK-клеток в тимусе, общность функции с Т-киллерами и даже наличие начальных признаков реаранжировки (D-J-типа) β-гена TCR в естественных киллерах. В то же время очевидна определенная реципрокность содержания в периферических лимфоидных органах NK-клеток и активности тимуса: численность и активность естественных киллеров у врожденно бестимусных и тимэктомированных мышей выше, чем у животных с нормальной функцией тимуса. Показано, что CD4- СD8_-клетки эмбрионального тимуса, несущие на поверхности Fcγ-peцептор II и/или III типа, могут развиваться в Т- или NK-клетки в зависимости от того, попадают ли они в тимическое или селезеночное микроокружение.

В процессе развития предшественников естественных киллеров в костном мозгу под влиянием ИЛ-1 экспрессируется β-цепь рецептора для ИЛ-2. После этого ИЛ-2 становится важнейшим фактором пролиферации и созревания NK-клеток. Вторым важным фактором, обусловливающим дифференцировку и активацию естественных киллеров, служит интерферон γ ИЛ-3, наоборот, подавляет развитие NK-клеток.



В норме содержание этих клеток особенно велико в селезенке, микроокружение которой, как полагают, необходимо для завершения развития NK-лимфоцитов. Они присутствуют также в лимфатических узлах и лимфоидных образованиях кишечника. В тимусе и костном мозгу зрелые NK-клетки не определяются, но присутствуют их предшественники, активируемые под влиянием ИЛ-2. Под действием ряда цитокинов, в первую очередь ИЛ-2, повышается литическая активность и расширяется спектр клеток — мишеней естественных киллеров. NK-клетки превращаются в ЛАК-клетки (см. раздел 2.2 и 4.3.2).

Info-Farm.RU

Фармацевтика, медицина, биология

Естественные киллеры

Естественные киллеры или NK-клетки — это большие гранулярные лимфоциты, являющиеся частью врожденного (неспецифического) иммунитета, поскольку, в отличие от Т- и В-лимфоцитов, на их поверхности отсутствуют антиген-специфические рецепторы. Естественные киллеры составляют 5-10% от общего количества лимфоцитов в крови человека. Они играют важную роль в защите организма от вирусных инфекций и является неотъемлемой составляющей противоопухолевого иммунитета.

Эти клетки проявляют цитотоксическое действие, путем высвобождения из цитоплазматических гранул белков перфорин и гранзимив, заставляющие клетку-мишень умирать путем апоптоза. Название «природные» означает, что они не требуют предварительной активации, для того чтобы уничтожить опасную для организма клетку.

История открытия

Открытие NK-клеток в 1976 году было частично случайным. Иммунологи проводили опыт по измерению противораковой активности лимфоцитов мышей. Животные предворительно имунизувались соответствующим типом злокачественно трансформированных клеток, как негативный контроль использовались лимфоциты из здоровых мышей и мышей, иммунизированных другим типом раковых клеток. К большому удивлению исследователей, контрольные лимфоциты проявляли хорошо выраженную противораковой активностью, осуществляя лизис перерождающихся клеток. Позже было выяснено, что это отвечали большие гранулярные лимфоцты, то есть естественные киллеры.



Для того чтобы выяснить, каким образом NK-клетки распознают свои мишени, ученые использовали модель отторжения трансплантатов костного мозга у мышей. Полученные данные позволили сформулировать гипотезу «отсутствующего я» (англ. Missing self), согласно которой естественные киллеры убивают все клетки, на поверхности которых отсутствуют эндогенные молекулы главного комплекса гистосовместимости класса И. Сейчас известно, что в регуляции активности NK-клеток действительно участвуют молекулы MHC класса I, но также задействованы и другие факторы.

Поверхностные детерминанты естественных киллеров

От других лимфоцитов человека естественные киллеры можно отличить по наличию на их мембране антигена CD56 (изоформы молекулы адгезии нервных клеток (англ. Neural cell adhesion molecule, NCAM) массой 140кДа) и отсутствием CD3, характерного для Т-лимфоцитов. Однако CD56 присутствует также на небольшой части Т-клеток. Также было выяснено, что эта детерминанта вообще отсутствует на NK-клетках мышей.

В 2007 году было предложено использовать маркер NKp46 (NK-активирующий рецептор) для выделения естественных киллеров из крови любого вида. Однако эта молекула была обнаружена также и на поверхности небольшого количества Т-цитотоксических клеток, более того, часть CD3- / CD56 + клетки не экспрессировали на мембране NKp46. Определение точного поверхностного фенотипа естественных киллеров, которое бы дозолило получать чистые поплуяции этих клеток продолжается.

Созревание естественных киллеров

Все лимфоциты развиваются из общих клетки-предшественников лимфоидного ряда, в свою очередь образуются из гемопоэтических стволовых клеток в костном мозге. Соответственно, в костном мозге имеются все промежуточные стадии развития В-лимфоцитов, и часть — Т-лимфоцитов. Остальные незрелых Т-клеток была выделена из тимуса, где они завершают свое развитие. Однако, промежуточные стадии созревания NK-клеток не были найдены ни в костном мозге, ни в тимусе.

На видимину от других лимфоцитов природные киллеры завершают свое развитие во вторичных лимфоидных органах (лимфатических узлах и миндалинах). Субпопуляция CD34 + / CD45RA + клеток-предшественников лимфоидного ряда (pro-NK-клетки) из костного мозга попадает в кровоток, и транспортируется к вторичным лимфоидных органов. В лимфатических узлах pro-NK-клетки выходят в парафолликулярными пространство, где происходит их дальнейшее созревание. Для развития этих клеток необходимо наличие в микроокружение интерлейкина 15 (ИЛ-15), который синтезируется некоторыми дендритных клеток. Промежуточными стадиями развития NK-клеток во вторичных лимфоидных органах является pro-NK, pre-NK, iNK (от англ. Immature) и CD56 bright NK (от англ. Bright — яркий). Последние отмечаются очень высоким уровнем экспрессии поврехневого белка CD56, взаимодействие которого с рецептором к фактору роста фибробластов-1, необходимой для завершения развития естественных киллеров. Зрелые NK-клетки, CD56 dim NK (от англ. Dim — тусклый), выходят в лимфу, с которой впоследствии попадают в кровь. Часть CD56 bright NK-клеток остается во вторичных лимфоидных органах, для регуляции функционирования некоторых клеток иммунной системы.



Функции естественных киллеров

Естественные киллеры является частью врожденного иммунитета, они задействованы в ранней ответы против вирусных инфекций и внутриклеточных бактерий. По сравнению с клетками специфического иммунитета (Т- и В-лимфоцитами) они имеют то преимущество, что не требуют долгой активации. Пик их активности приходится на 3-й день после начала инфекции, тогда как для цитотоксических Т-лимфоцитов он наступает аж на 7-й день. Кроме того NK-клетки дополняют действие Т-цитотоксических клеток, уничтожая недоступны для них клетки с уменьшенной или отсутствующей экспрессией белков главного комплекса гистосовместимости. Наконец, естественные киллеры, могут еще и регулировать иммунный ответ производя различные цитокины, в частности интерферон-γ. Тяжелые последствия недостатка естественных киллеров в организме человека могут быть проиллюстрированы на примере синдрома Чедиак-Хигаси. Вследствие дисфункции NK-клеток и нейтрофилов больные страдают от повышенной склонности к инфекциям и развития лейкимии и лимфом.

Функции, которые выполняют естественные киллеры можно разделить на два основных типа: продуцирования цитокинов, регулирующих работу других клеток иммунной системы, и непосредственное уничтожение поврежденных клеток, происходит при участии перфорин / гранзимив или рецепторов смерти.

Образование интерферона-γ

Часть субпопуляции CD56 bright NK-клеток остается во вторичных лимфоидных органах, там они находятся в непосредственной близости к Т-гелперив и многих антиген-презентуя клеток. Эти клетки могут влиять друг на друга, синтезируя различные наборы цитокинов. Естественные киллеры частности выделяют интерферон-γ (ИФН-γ), который может выполнять следующие функции:

  • стимулирует Т-гелперы 1 (отвечают за запуск клеточного иммунитета)
  • активирует антиген-презентуя клетки и способствует увеличению экспрессии MHC класса I;
  • активирует уничтожения макрофагами облигатных внутриклеточных паразитов;
  • подавляет пролиферацию зараженных вирусами и раковых клеток.

Для того, чтобы природный киллер начал синтезировать ИФН-γ он должен получить два сигнала, один из которых всегда является интерлейкин 12 (ИЛ-12), а другим может быть ИЛ-1, ИЛ-2, ИЛ-15, ИЛ-18 или сигнал от рецепторов активации NK-клеток, таких как CD16 (FcγRIIIa) или NKG2D. Все вышеуказанные цитокины могут синтезироваться моноцитами, макрофагами и / и дендритные клетки. Выработка интерферона-γ и других провоспалительных цитокинов и хемокинов естественными киллерами начинается через несколько минут после их стимуляции, отличает их от Т-лимфоцитов, которые требуют длительной активации.

Провоспалительные цитокины, выделяемые NK-клетками не только активируют другие клетки иммунной системы, а также и стимулируют их к секреции ИЛ-10 и трансформирующего фактора роста-β, которые в свою очередь подавляют сами NK-клетки. Таким образом эта система регулируется на основе отрицательной обратной связи.

Антитело-зависимая клеточная цитотоксичность

Зрелые естественные киллеры, циркулирующих в крови, имеют значительно более высокую способность к цитолитической действия, чем CD56 bright NK-клетки, которые остаются в лимфатических узлах. Также зрелые NK-клетки имеют более низкий уровень экспрессии CD56, зато на их мембране в большем количестве имеется маркер CD16. CD16 — это низькоафинний Fcγ рецептор Ша, что присоединяется к костантного домена антител иммобилизованных на поверхности клетки. Присоединение FcγIIIA к антитела приводит к дегрануляции природного киллера, в результате чего происходит перфорин-зависимый лизис клетки-мишени. Такое действие называется антитело-зависимой клеточной цитотоксичности (англ. Antibody-dependent cellular cytotoxicity).

Антитело-зависимая клеточная цитотоксичность наблюдалась после введения больным раком препаратов на основе моноклональных антител: трастузумаб (англ. Trastuzumab) и ритуксимаб (англ. Rituximab). После присоединения антител к злокачественным клеткам, последние разрушались в основном естественными киллерами. В осуществлении антитело-зависимой клеточной цитотоксичности могут участвовать и другие клетки неспецифической иммунной системы (нейтрофилы, эозинофилы, макрофаги, моноциты).

Активация естественных киллеров независимая от антител

Естественные киллеры могут осуществлять лизис клеток-мишеней даже без участия антител. Поскольку они не имеют на своей поверхности антиген-специфических рецепторов, механизм по которому NK-клетки распознают свои мишени некоторое время оставался непонятным. Первой гипотезе, которая объясняла такое распознавания, была гипотеза «отсутствующего я» (англ. Missing self). Она утверждала, что природный киллер будет убивать любую клетку, на поверхности которого нет достаточного количества эндогенных молекул MHC класса I. Позже было выяснено, что эта гипотеза была слишком упрощенной, на самом деле NK-клетки содержат большое количество рецепторов активации и ингибирования, сигналы от которых участвуют в регуляции цитотоксической активности NK-клеток.

Ингибирующие рецепторы естественных киллеров

К ингибирующих рецепторов естественных киллеров относятся:

  • Несколько типов KIR (англ. Killer immunoglobulin-like receptor), распознающие классические молекулы MHC класса Ia (HLA-A, HLA-B и HLA-C);
  • Гетеродимерний рецептор CD94 / NKG2A, что взаимодействует с неклассическими молекулами MHC класса Ib (HLA-E).

Ингибиторные сигналы, поступающие от этих рецепторов после их взаимодействия с эндогенными молекулами главного комплекса гистосумиснотси способны подавлять любой активирующий сигнал.

В геноме человека существует несколько десятков генов, кодирующих различные молекулы KIR, и каждая NK-клетки экспрессируют только часть из них. Определение правильного набора ингибиторных рецепторов, которые будут распознавать именно собственные эндогенные молекулы MHC данного организма, происходит в процессе «образования» естественных киллеров.

Во многих инфицированных вирусами и злокачественно перерождающихся клеток уровень экспрессии MHC класса I резко снижается (таким образом они могут избежать цитотоксического действия Т-лимфоцитов), эти клетки могут стать мишенями для NK-клеток.



Активирующие рецепторы естественных киллеров

Цитотоксическое действие естественных киллеров зависит от динамического равновесия между ингибиторной и активирующими рецепторами. Для лизиса клетки-мишени недостаточно одной только видсунтности подавляющего сигнала, необходимо также наличие активирующего, который может поступать от одного из следующих рецепторов:

  • NKG2D
  • NCR
  • нектин и нектин-образные рецепторы
  • NKp80 и некоторых других.

Лучше охарактеризован рецептор NKG2D, распознающий по крайней мере шесть различных лигандов (три из них является трансмембранными белками (MICA, MICB и ULBP-4), еще три — гилкофосфатидилинозитол-заякорена (например ULPB-4)). Эти лиганды отсутствуют на поверхности нормальных клеток организма, а появляются в случае генотоксического или клеточного стресса, возникающего, например, при заражении вирусом или злокачественном перерождении.

Механизм цитотоксического действия

Естественные киллеры могут проявлять цитотоксичность одним из двух путей:

  • Большинство NK-клеток имеют своей поврехни белок FasL, который при активации присоединяется к рецептору смерти Fas на поверхности клетки-мишени и таким образом активирует в ней апоптоз;
  • Естественные киллеры содержат гранулы заполненные белками перфорин и гранзимамы, при активации происходит дегрануляция клеток. При этом перфорины встраиваются в мембрану мишени и образуют каналы, это само по себе может вызвать осмотическое лизис клетки. Кроме того, через эти каналы в цитоплазму клетки могут попадать протеазы гранзимы, которые запускают каскад реаций активации апоптоза.

Как работают Т-клетки иммунной системы

Т-клетки это фактически приобретенный иммунитет, способный защитить от цитотоксического повреждающего воздействия на организм. Чужеродные клетки-агрессоры, попадая в организм вносят “хаос”, который внешне проявляется в симптомах заболеваний.

Клетки-агрессоры повреждают по ходу своей деятельности в организме все, что могут, действуя в своих интересах. А задача иммунной системы найти и уничтожить все чуждые элементы.



Специфическая защита организма от биологической агрессии (чужеродных молекул, клеток, токсинов, бактерий, вирусов, грибов и т.д.) осуществляется при помощи двух механизмов:

  • продуцирования специфических антител в ответ на чужеродные антигены (потенциально опасных для организма веществ);
  • выработки клеточных факторов приобретённого иммунитета (Т-клетки).

Как осуществляются иммунные реакции

Процесс запоминания (презентация) происходит благодаря антиген-распознающим рецепторам клеток и работе антиген представляющих молекул (МНС молекул- комплексов гистосовместимости).

Что такое Т-клетки иммунной системы, и какие функции они выполняют

Функционирование иммунной системы обуславливается работой лимфоцитов . Это клетки иммунной системы, являющиеся разновидностью лейкоцитов и способствующие формированию приобретённого иммунитета. Среди них выделяют:

  • В-клетки (распознающие «агрессора» и вырабатывающие к нему антитела);
  • Т-клетки (выполняющие функцию регулятора клеточного иммунитета);
  • NК- клетки (разрушающие отмеченные антителами чужеродные структуры).

Однако, помимо регуляции иммунного ответа, Т-лимфоциты способны выполнять эффекторную функцию, разрушая опухолевые, мутировавшие и чужеродные клетки, участвовать в формировании иммунологической памяти, распознавать антигены и индуцировать иммунные реакции.

Разнообразие функций Т-лимфоцитов обусловлено наличием в них субпопуляций, представленных Т-хелперами, Т-киллерами и Т-супрессорами.



Субпопуляция клеток, их стадия дифференцирования (развития), степень зрелости и т.д. определяется при помощи специальных кластеров дифференцировки, обозначаемых как СD. Наиболее значимыми являются СD3, СD4 и СD8:

  • СD3 находится на всех зрелых T-лимфоцитах, он способствует передаче сигнала от рецептора к цитоплазме. Это важный маркер функционирования лимфоцитов.
  • СD8 — это маркер цитотоксических T-клеток.
  • СD4 является маркером T-хелперов и рецептором к ВИЧ (вирус иммунодефицита человека)

Т-хелперы

В зависимости от продуцируемого цитокина, их разделяют на:

  • T-хелперные клетки 1-го класса (продуцируют интерлейкин-2 и гамма-интерферон, обеспечивая гуморальный иммунный ответ на вирусы, бактерии, опухоли и трансплантанты).
  • T-хелперные клетки 2-го класса (секретируют интерлейкины-4,-5,-10,-13 и отвечают за образование IgЕ, а также иммунного ответа, направленного на внеклеточные бактерии).

Т-хелперы 1-го и 2-го типа всегда взаимодействуют антагонистически, то есть повышенная активность первого типа угнетает функцию второго типа и наоборот.

Работа хелперов обеспечивает взаимодействие между всеми клетками иммунитета, определяя какой тип иммунного ответа будет преобладать (клеточный либо гуморальный).

Т-киллеры

Это так называемые T-эффекторы (цитотоксические клетки) или клетки убийцы. Такое название обусловлено их способностью уничтожать клетки-мишени. Осуществляя лизирование (ли́зис (от греч. λύσις — разделение) — растворение клеток и их систем) мишеней, переносящих чужеродный антиген или мутировавший аутоантиген (трансплантанты, опухолевые клетки), они обеспечивают реакции противоопухолевой защиты, трансплантационного и противовирусного иммунитета, а также аутоиммунные реакции.



Т-киллеры при помощи собственных МНС-молекул распознают чужеродный антиген. Связываясь с ним на поверхности клетки, они продуцируют перфорин (цитотоксический белок).

После лизирования клетки «агрессора» Т-киллеры остаются жизнеспособными и продолжают циркулировать в крови, разрушая чужеродные антигены.

Т-киллеры составляют до 25-ти процентов от всех Т-лимфоциотов.

Это может проявляться лекарственными аллергиями и различными аутоиммунными заболеваниями (системные заболевания соединительной ткани, гемолитическая анемия аутоиммунного характера, злокачественная миастения, аутоиммунные тиреоидиты, и т.д.).

Подобным механизмом действия обладают некоторые лекарственные средства, способные запускать процессы некроза опухолевых клеток.



Например, к таким медикаментам относится Хлорбутин. Это средство применяют для лечения хронического лимфолейкоза, лимфогранулематоза и рака яичников.

Т-супрессоры и клетки памяти

Помимо основных T-лимфоцитов, в организме человека существуют потомки клеток, контактировавших с антигеном и имеющих к нему рецепторы. Это клетки обеспечивающие иммунологическую память. Они способны в течение от десяти до 15 лет сохранять память об антигене, передавая её другим клеткам.

Нулевые лимфоциты

К ним относят лимфоциты, не имеющие T и B маркеров. Они составляют до 10% от всей популяции лимфоцитов. К ним относят NК-клетки (естественные киллеры) и K-клетки (киллерные).

K-клетки отвечают за антителозависимую клеточную цитотоксичность. Они отражают взаимодействия гуморального и клеточного звеньев иммунитета, а также выступают в качестве «наводчиков» эффекторных (выполняющих функцию – в данном случае уничтожение) клеток на мишень.

NК- клетки обеспечивают контроль за качеством клеток и участвуют в формировании противовирусного иммунитета, обеспечиваютзащиту от роста опухолей и размножения мутировавших (дефектных) клеток.



Диагностика клеточного иммунитета

Диагностика T- и B-лимфоцитарного звена позволяет оценить состояние клеточного иммунитета. Базовое исследование с определением процентного содержания Т-, В- и нулевых клеток проводится с целью выявления первичных или вторичных иммунодефицитов, а также при контроле иммуностимулирующего лечения.

Исследование основных популяций при помощи маркеров CD3, 8, 19, 16+5б, а также соотношение между хелперами и киллерами, позволяет комплексно оценить иммунный статус. Для исследования используют венозную кровь.

Диагностика проводится при выявлении и контроле течения:

  • аутоиммунных заболеваний (увеличено содержание CD3, CD4 хелперов);
  • лимфолейкозов (повышено количество Т-лимфоцитов CD3);
  • злокачественных новообразований (увеличено количество NK);
  • ВИЧ (CD3, CD8);
  • хронических инфекций, аллергических реакций, бронхиальной астмы и т.д.

Т-киллеры [Цитотоксические Т-лимфоциты]

Т-киллеры или цитотоксические Т-лимфоциты (от англ. to kill — убивать), — это иммуноциты, наделенные непосредственными эффекторными функциями. Часто Т-киллеры называют CD8+ Т-лимфоцитами, поскольку маркером этой субпопуляции служит корецептор CD8. Существуют по крайней мере две группы этих клеток, а именно: Тс 1 и Тс 2, каждая из которых продуцирует особенный комплект цитокинов.

В циркуляции цитотоксические Т-лимфоциты существуют в виде клеток-предшественников. Для их активации и созревания, что происходит при содействии Т-хелперов, необходимо определенное время (около 7-10 дней).



Функции Т-киллеров

Т-киллеры, как и Т-хелперы, являются специализиро­ванными иммунными клетками, способными распознавать антигены поражен­ных клеток, т.к. содержат антигенраспознающие рецепторы. Для этого последние должны быть представлены в виде иммуно­генных пептидов в комплексе с молекулами HLA I (рис. 30). При специфическом распознавании мишеней Т-киллеры выделяют лимфотоксин (ФНО-β), перфорин и гранзимы, обеспечивающие апоптотическую или некротическую гибель скомпрометированных клеток.

Fas-лиганд

В отличие от ЕК, Т-киллеры обладают более прицельным действием, в связи с чем они опаснее для потенциальных клеток-мишеней. Кроме того, спектр цитотоксических ме­ханизмов у Т-киллеров шире, чем у ЕК. Так, кроме осмотического лизиса и индукции апоптоза при введении гранзимов, они экспрессируют Fas-лиганд (FasL), который при взаимодействии с Fas-рецептором способен индуцировать апоптоз измененных клеток. Материал с сайта http://wiki-med.com

Fas-рецептор

Экспрессия Fas-рецептора значительно повышается на клетках, находящихся в критической ситуации (злокачественная трансформация или вторжение виру­са) в случае невозможности самостоятельной индукции апоптоза. Любая клетка содержит множество сигнальных подсистем, функционирующих до определен­ной степени автономно, а потому опухолевая трансформация или вирус не могут (во всяком случае сразу) совершить полный захват регуляторных механизмов клетки. При поражении клетки активация некоторых из таких подсистем при­водит к экспрессии маркеров готовности к апоптозу, что обуславливает последующую элиминацию измененной клетки. Так, например, рецептор Fas, сигнали­зирующий о готовности клетки к апоптозу, распознается Т-киллером, который и включает механизм ее самоликвидации. В противном случае цитотоксическая Т-клетка выделяет гранзимы и перфорин.

Защита Т-киллера от собственных факторов агрессии

Возникает вопрос, каким образом Т-киллер защищается от собственных фак­торов агрессии? Дело в том, что цитотоксические лимфоциты накапливают агрессивные молекулы в специальных микрогранулах, в которых поддержи­вается низкое pH и почти отсутствуют ионы Са 2+ , что удерживает перфорин и гранзимы от преждевременной активации.

/ NK-клетки

Лимфопоэз. Созренивание лимфоцитов в костном мозге

Лимфоидный росток гемопоэза в костном мозге представлен В-, Т- и NK-клеточными линиями. Клетки-предшественники имеют морфологическую характеристику бластов или зрелых лимфоцитов. В костном мозге В- и Т-лимфобласты составляют очень небольшую долю клеток (менее 0,5 %), лимфоциты — 4,3-13,7 %.



В-лимфоидные предшественники в костном мозге — центральном органе В-лимфопоэза проходят антигеннезависимую стадию созревания. При этом происходит перестройка (реаранжировка) генов иммуноглобулинов, расположенных на хромосомах 2, 22 и 14. Отдельные этапы дифференцировки характеризуются появлением специфичных макромолекул, определяющих иммунофенотип клеток.

На самых ранних про-В-клетках сохраняются антигены стволовых элементов (CD34 и CD38) и появляются специфические макромолекулы пан-BCD19, а затем цитоплазматический CD22. Эти антигены характерны для всех элементов В-лимфоидного ряда. Затем на пре-В-клетках снижается содержание стволово-клеточных и появляются другие В-антигены — CD 10, CD20 и CD24. Следующий этап созревания (npe-В-бласты) характеризуется появлением в цитоплазме клеток (J-цепи Ig. На последнем этапе костномозговой В-дифференцировки на мембране лимфоидных элементов экспрессируется полная молекула (легкие и тяжелые цепи) IgM.

После этого морфологически зрелые, но иммунологически «наивные» В-лимфоциты попадают в кровь и в периферические органы иммунной системы: лимфатические узлы, селезенку и др. Там после контакта с антигеном в зародышевых центрах вторичных лимфоидных фолликулов они проходят антигензависимую стадию дифференцировки. В итоге формируется пул зрелых В-лимфоцитов и плазматических клеток, способных синтезировать и продуцировать иммуноглобулины разных классов, что позволяет им принимать участие в регуляции и осуществлении гуморального ответа иммунной системы.

Предшественники Т-клеток в костном мозге характеризуются экспрессией стволово-клеточных (CD34, HLA-Dr) и Т-антигенов (CD7, цитоплазматический CD3±). Сначала Т-предшественники мигрируют в тимус, который является центральным органом Т-лимфопоэза, а затем поступают в периферические лимфоидные органы, где проходят антигензависимую стадию дифференцировки. В вилочковой железе осуществляется перестройка генов, кодирующих Т-клеточный рецептор (TCR), и TCR появляется на поверхностной мембране. Этот рецептор совместно с белками-продуктами гена главного комплекса гистосовместимости распознает и связывает антигены. Большинство Т-лимфоцитов крови экспрессируют а- и бета-цепи TCR, в то время как Т-лимфоциты эпителия кишечника и слизистой оболочки влагалища — у-и сигма-цепи.

T-лимфоциты: этапы внутритимусной дифференцировки.



Этапы внутритимусной дифференцировки клеток от мигрировавшего в орган костномозгового предшественника (пре-Т-клеток) до зрелого T-лимфоцита, покидающего тимус, связаны с изменением экспрессии фенотипических Т-клеточных маркеров. Основными из них являются: CD4 — корецептор T-хелперов , CD8 — корецептор цитотоксических T-лимфоцитов (T-киллеров) и альфа-бета ТКР (Т-клеточный антигенраспознающий рецептор). Специфическая комбинация этих поверхностных молекул может быть использована в качестве маркеров дифференцировки клеток в тимусе.

Табл.1 Фенотипические маркеры дифференцирующихся тимоцитов

Тип дифференцирующихся тимоцитов

На первом этапе из плюрипотентной гемопоэтической стволовой клетки (СКК) костного мозга, обеспечивающей миело- и лимфопоэз, образуется общий для Т- и В-лимфоцитов предшественник.

Ближайшим потомком предшественником Т-лимфоцитов является протимоцит или коммитированный предшественник Т-клеток (пре-Т-кл.). Характерным маркером пре-Т-клеток костного мозга является один из антигенов мозга (АМ). Первые мигрирующие в субкасулярную область тимуса пре-Т-клетки теряют АМ, но приобретают типичный маркер тимоцитов и периферических Т-клеток — Thy-1. Тимоциты субкапсулярной зоны являются в основном двойными негативами и не экспрессируют Т-клеточный рецептор (ТКР). Фенотип таких клеток СD4-CD8-альфа-бета-ТКР-.



Постепенно по мере перемещения в корковый слой тимоциты начинают экспрессию как CD4, так и CD8 корецепторов, а также ТКР. Медуллярная зона тимуса — место локализации бластных форм с фенотипом, характерным для самостоятельных субпопуляций Т-клеток (CD4+CD8-альфа-бета-ТКР+ — Т-хелперы/индукторы; CD4-CD8+альфа-бета-ТКР+).

Отсюда и их название » двойные негативы «. Они заселяют верхнюю часть коры тимуса, расположенную непосредственно под капсулой органа — субкапсулярную область. В полностью развитом тимусе двойные негативные клетки составляют незначительный, всего около 5% от общего числа тимоцитов клеточный пул.

Зрелые Т-лимфоциты присутствуют в периферической крови, в тимусзависимых областях селезенки, лимфатических узлов, миндалин, пейеровых бляшек. В периферической крови Т-лимфоцитарный пул представлен двумя фракциями — хелперами/эффекторами (CD4+) и супрессорами/цитотоксическими клетками (CD8+). Т-лимфоциты CD4+ разделяются на два субтипа: Т-хелперы-1 (Тh1) и Т-хелперы-2 (Th2). Клетки первого типа способны усиливать синтез и продукцию клетками Ig, клетки второго типа — индуцировать антигенспецифическую активность Т-супрессоров.

Т-лимфоидные клетки не синтезируют и не секретируют иммуноглобулины. Они обладают способностью производить белки и гормоны (цитокины), которые регулируют пролиферацию и дифференцировку других клеток, принимают участке в клеточном иммунном ответе.

Естественные (натуральные) киллеры (NK-клетки) имеют независимую линию дифференцировки. В периферической крови они морфологически характеризуются как большие гранулированные лимфоциты с ядром с небольшой выемкой и большими азурофильными гранулами. Их фенотип CD3-, CD16+, CD56+. Они не имеют перестройки TCR, экспрессируют на мембране рецептор к CR2 (CМ). вирусу Эпштейна—Барр, Fc-рецептор — для IgG. NK-клетки способны отвечать за спонтанную клеточную цитотоксичность.



NK-клетки не проходят дифференцировку в тимусе, они выходят из костного мозга в кровь и затем мигрируют в ткани, где осуществляют врожденную иммунную защиту, называемую естественной цитотоксичностью, которая особенно важна для защиты организма от вирусов и опухолей.

Дифференцировка разных популяций NK-клеток происходит из общего предшественника лимфоидных клеток под воздействием цитокина IL-15, продуцируемого стромальными клетками костного мозга. На начальных этапах дифференцировки гемопоэтические стволовые клетки приобретают фенотип CD34bright CD122+ (IL-2Rβ+ IL-15Rβ+) CD56– и в ответ на стимуляцию IL-15 развиваются в зрелые NK-клетки. Такой путь дифференцировки характерен для преобладающих в периферической крови CD16bright CD56dim NK-клеток. В лимфатических узлах основной пул стволовых клеток составляют клетки-предшественники с фенотипом CD34dim, конститутивно экспрессирующие CD45RA, L-селектин, LFA-1 (lymphocyte function-associated antigen-1), β7-интегрин и высокоаффинный рецептор к IL-2 – IL-2Rαβγ. Эти гемопоэтические стволовые клетки, мигрировавшие в лимфатические узлы из костного мозга, могут дифференцироваться в CD16dim CD56bright NK-клетки после стимуляции IL-2 или IL-15. При этом клетки с фенотипом CD34dim CD45RA+β7high не являются предшественниками CD56dim NK-клеток, что дает основание говорить о двух независимых путях дифференцировки NK-клеток. Однако после стимуляции IL-2 CD16dim CD56bright NK-клетки лимфатических узлов могут приобретать фенотип CD16bright CD56dim и проявлять цитотоксические свойства . По другим данным, CD16bright CD56dim NK-клетки в ткани при воздействии на них IL-12 могут изменять свой фенотип на CD16dim CD56bright. Таким образом, дифференцировка основной популяции NK-клеток периферической крови (CD16bright CD56dim) происходит в костном мозге, в дальнейшем под воздействием IL-12 в ткани они могут приобретать фенотип CD16dim CD56bright. Дифференцировка CD16dim CD56bright NK-клеток также происходит в костном мозге, однако более точный фенотип предшественников этой популяции NK-клеток еще предстоит уточнить. Основным же путем образования CD16dim CD56bright NK-клеток является их дифференцировка из клеток-предшественников в лимфатических узлах.

NK- клетки: общая характеристика.

Нормальные киллеры или NK (от англ. natural killer )- эффекторные клетки врожденной иммунной системы, осуществляющие прямую цитотоксическую функцию без предварительной активации.

Это большие зернистые лимфоциты с характерной морфологией: основная часть обильной цитоплазмы содержит несколько митохондрий , свободные рибосомы с отдельными элементами шероховатого эндоплазматического ретикулума , аппарат Гольджи и характерные электроноплотные гранулы, связанные с мембраной. Большие зернистые лимфоциты с активностью нормальных киллеров выполняют цитотоксические функции, также как и цитотоксические T- лимфоциты.



Основная обязанность киллерных клеток — выявлять и уничтожать собственные клетки организма, в которых что-то нарушилось: они убивают опухолевые клетки и клетки, зараженные вирусами (а также, возможно, и другими чужеродными агентами).

Нормальные киллеры (НК-клетки) у человека составляют примерно 5% лимфоцитов периферической крови. Чаще всего они имеют фенотип CD3-CD16+CD56+CD94+ и гаметное (неперестроенное) расположение генов. Таким образом, хотя НК относятся к лимфоидным клеткам, они лишены маркеров Т- и В-лимфоцитов.

Морфологически NK-клетки представляют собой большие гранулярные CD3-негативные лимфоциты, экспрессирующие поверхностную молекулу CD56. В настоящее время по характеру экспрессии поверхностных маркеров NK-клетки можно подразделить на 48 различных популяций. Однако традиционно среди NK-клеток выделяют две группы: CD3– CD16bright CD56dim и CD3– CD16dim CD56bright. Большинство NK-клеток периферической крови слабо экспрессируют CD56 и интенсивно экспрессируют CD16 (CD16bright CD56dim). Для этих клеток характерно наличие большого количества лизосомальных гранул, содержащих гранзимы и перфорины. Другие популяции NK-клеток периферической крови экспрессируют CD56, но слабо или совсем не экспрессируют молекулы CD16 (CD16dim CD56bright и CD16–CD56bright). Популяции CD16dim CD56bright и CD16–CD56bright обладают регуляторными свойствами, однако под воздействием цитокинов свойства и функции этих NK-клеток могут изменяться. Так, интерлейкин (IL)-2 модулирует как фенотип, так и цитотоксическую функцию

NK-клеток: в экспериментах in vitro при стимуляции IL-2 CD16dim CD56bright NK-клеток уровень цитотоксичности этой популяции NK-клеток становился сходным с уровнем цитотоксичности СD16bright CD56dim NK-клеток.

При связывании NK-клеток с клеткой-мишенью образуется иммунологический синапс. В случае если клетка-мишень является вирусинфицированной или опухолевой, формируется межклеточный комплекс, передающий активационный сигнал NK-клетке. Формирование иммунологического синапса и запуск дальнейших реакций представляют собой процесс, включающий взаимодействия адгезионных молекул, С-лектиноподобных рецепторов, рецепторов KIR NK-клеток с лигандами на клетках-мишенях. Контакт NK-клетки с клеткой-мишенью вызывает агрегацию фибриллярного актина, талина и других белков цитоскелета, что приводит к высвобождению перфоринов и гранзимов. При контакте NK-клетки с клеткой-мишенью, несущей на своей мембране MHC-I (major histocompatibility complex) с собственным клеточным пептидом, формируется ингибиторный иммунологический синапс, препятствующий активации NK-клетки. Экспрессия большинства MHC-I специфичных рецепторов на NK-клетках клоноспецифична: для NK-клеток характерна экспрессия как минимум одного ингибирующего рецептора, при этом активационные рецепторы NK-клетка может не экспрессировать. В табл. 1 приведены данные о рецепторах NK-клеток и их лигандах на мембране клеток-мишеней. Следует отметить, что в настоящее время значительная часть лигандов рецепторов NK-клеток не выявлена.



NK: противовирусная активность.

Натуральные (нормальные) киллеры (НК) представляют собой популяцию лимфоидных клеток, лишенных признаков Т-лимфоцитов или В-лимфоцитов .

Первоначально натуральные киллеры были обнаружены по их способности убивать лимфоидные опухолевые клетки in vitro без какого- либо предварительного примирования . В дальнейшем стало известно, что эти клетки принимают участие в неспецифической защите против некоторых вирусных и бактериальных внутриклеточных патогенов.

Активные НК-клетки появляются уже через двое суток после заражения хозяина вирусом. Активность их усиливается враз под влиянием цитокинов ИФ-альфа и ИФ-бета , а также ИЛ-12 , продуцируемого макрофагами в ранний период развития инфекции.

ИЛ-12 совместно с ФНО-альфа, также образуемым макрофагами, обеспечивает активную секрецию ИФ-гамма НК-клетками. Секреция ИФ-гамма также повышает функциональную активность НК-клеток, что создает условия ранней защиты от некоторых инфекций до тех пор, пока в реакцию не вступят Т-клетки , продуцирующие тот же цитокин.

Механизм дифференциации собственных интактных соматических клеток от таких же клеток, но инфицированных вирусом связан с двумя рецепторами, экспрессирующимися на мембране НК-клеток. Один из них — NKR-P1 — является основным в реализации киллерной функции данных клеток. В результате взаимодействия этого рецептора с соответствующим лигандом на любой из возможных клеток создаются условия для реализации киллерного действия. При этом действие НК-клеток против собственных нативных клеток блокируется вторым рецептором — Ly49 , способным контактировать с молекулами I класса МНС , что предотвращает лизис нативных собственных клеток.

Инфицированные вирусом клетки становятся чувствительными к НК одним из двух способов.

Во-первых, некоторые вирусы подавляют белковый синтез в клетках хозяина. Вследствие этого усиленный синтез молекул I класса МНС, индуцированный интерфероном, может селективно блокироваться в вирусинфицированных клетках. Это, в свою очередь, приведет к тому, что Ly49-рецептор будет не в состоянии предотвращать киллерную активность НК-клеток.

Вторая возможность состоит в том, что некоторые вирусы препятствуют экспрессии молекул I класса МНС, что также делает вирусинфицированные клетки объектом киллерного действия НК-клеток.

Интерферон IFN1: продукция НК-клетками

При сравнении интерферон-секретирующей способности больших гранулярных лимфоцитов (НК) и малых Т-лимфоцитов в ответ на стимуляцию вирусом гриппа было показано, что основной вклад в продукцию IFN-альфа вносили НК-клетки . Уровень IFN в этих опытах составлял примерно 103u/мл и на порядок превосходил секрецию интерферона Т-клетками.

Перфорин — мономерный белок, вызывающий образование пор в цитоплазматической мембране. По структуре и функции он близок к C9 .

К настоящему времени в гранулах цитотоксических Т-лимфоцитов и NK- клеток обнаружен только один образующий поры белок — перфорин. Его молекулярная масса 70 тыс. дальтонов. Если клетки инкубировать с перфорином в присутствии ионов кальция , они через несколько минут лизируются. Однако, если ионы кальция добавить к перфорину до того, как он свяжется с клетками, то белок совершенно не проявляет свою лизирующую способность. Этот парадоксальный на первый взгляд факт многое проясняет в механизме действия перфорина на клетки.

Киллерная клетка выделяет молекулы перфорина, и эти молекулы встраиваются в мембрану клетки-мишени. Там они полимеризуются, т. е. соединяются друг с другом. Полимеризация происходит только в присутствии ионов кальция. Образующийся полимер может принимать различные конфигурации, но в оптимальных условиях конечный продукт полимеризации имеет форму цилиндра. При электронной микроскопии он выглядит как кольцо, если ориентирован вдоль пучка электронов, и как две параллельных линии — если поперек. Внутренний диаметр цилиндра, по данным Подана и Деннерта, варьирует от 5 до 20 нм.

Чтобы перфорин повредил клетку-мишень, его полимеризация должна происходить внутри мембраны, так как внедриться в мембрану могут только мономеры перфорина. Если полимеризация произойдет в растворе, то полимер не сможет проникнуть затем в мембрану и убить клетку. Смысл этого понятен: оказавшись во внеклеточном пространстве или кровотоке, где в избытке имеется кальций, перфорин быстро полимеризуется и становится неактивным, что исключает возможность случайного повреждения других, нормальных клеток организма.

Образование в клеточной мембране пор в результате полимеризации перфорина приводит к быстрому и легко наблюдаемому изменению состояния клетки.

Показано, что белки последних стадий каскада комплемента имеют значительную гомологию с перфорином : аминокислотные последовательности перфорина и этих белков во многих участках идентичны. Такое сходство между элементами гуморальной и клеточной иммунных систем не может быть случайным. Мы полагаем, что белки-убийцы обеих систем произошли от одного предкового белка и со временем дивергировали, специализируясь каждый для своей роли.

Антителозависимая клеточная цитотоксичность.

NK могут выполнять цитотоксические функции. Однако их специфичность сильно ограничена и, чтобы повысить эффективность действия, необходимо расширить пределы этой специфичности.

Один путь решения проблемы заключается в следующем: клетка-мишень нагружается антителами , узнающими поверхностные антигены вируса, поскольку как и фагоциты , NK имеют рецепторы для константной части молекулы антитела. Антитела, формируя мостик, способствуют тесному сближению NK и мишени, т.е. фокусируют неспецифический разрушительный механизм нормальных киллеров. Таким образом, NK, активированный связанными с клеткой-мишенью антителами, способен уничтожить клетку, инфицированную вирусом. Эта система, получившая название » антителозависимая клеточная цитотоксичность «, очень эффективна in vitro, но не ясно, в какой степени она используется в организме.

NK-Лимфоциты: оценка функциональной активности.

Цитотоксичность NK-лимфоцитов не зависит от предварительной иммунизации и не ограничена по HLA. Цитотоксическую активность NK-лимфоцитов оценивают, используя в качестве клеток-мишеней разные линии трансформированных клеток, чувствительных к действию NK-лимфоцитов. Разрушение клеток-мишеней осуществляется лишь при образовании тесного контакта с NK-лимфоцитами. Этот контакт может быть прямым или опосредованным, при котором NK-лимфоциты прикрепляются к покрытым IgG клеткам-мишеням через рецептор к Fс-фрагменту IgG — антителозависимая клеточная цитотоксичность . Благодаря этому механизму могут быть разрушены клетки-мишени, первоначально устойчивые к действию NK-лимфоцитов.

Антителозависимую клеточную цитотоксичность оценивают с помощью стандартного метода, используя клетки-мишени, покрытые антителами класса IgG.

NK-лимфоциты играют важную роль в противовирусном и противоопухолевом иммунитете и участвуют в отторжении трансплантата. Снижение цитотоксической активности NK-лимфоцитов выявляется при многих заболеваниях, в том числе при злокачественных новообразованиях , а отсутствие наблюдается крайне редко.

Активация NK-лимфоцитов цитокинами.

После инкубации с определенными цитокинами цитотоксическая активность NK-лимфоцитов значительно повышается. Так, при добавлении интерферона гамма активность NK-лимфоцитов повышается уже через несколько часов. После инкубации с интерлейкином-2 в течение нескольких суток NK-лимфоциты становятся активными в отношении любых трансформированных клеток-мишеней, в том числе опухолевых клеток. В настоящее время исследуется возможность применения активированных цитокинами NK-лимфоцитов при некоторых злокачественных новообразованиях.

Интерферон: активация NK.

Натуральные киллеры являются важным фактором неспецифической защиты от вирусной инфекции . Они участвуют в так называемой естественной или спонтанной цитотоксичности в отношении клеток-мишеней. НК-лимфоциты не имеют маркеров Т- и В-клеток. Свое цитотоксическое действие на клетки-мишени они оказывают без участия антител.

В отличие от НК другая популяция лимфоцитов, так называемые К-лимфоциты , отвечают за зависимую от антител цитотоксичность и обеспечивают лизис инфицированных вирусом клеток, на поверхности которых экспонированы вирусные антигены, связанные с антителами, специфичными к данным антигенам.

НК- и К- лимфоциты обладают более высокоавидными Fc-рецепторами по сравнению с Fc-рецепторами Т- и В-клеток, и относятся к популяции нуль-лимфоцитов. Активность НК- и К-лимфоцитов может в значительной степени контролироваться (увеличиваться) интерфероном ( Lang et al., 1982 ; Biron, Welsh, 1982 ).

Показано, что любой интерферон (альфа, бета и гамма) вызывает активацию НК как in vitro, так и in vivo ( Biron, Welsh, 1982 ). При этом имеется выраженная корреляция между уровнем интерферона и активностью НК.

Важным моментом регуляции активности интерферона при вирусной инфекции является то, что in vivo активация НК интерфероном происходит вблизи инфицированных вирусом клеток, т.е. интерферон действует локально, так как его продуцируют либо инфицированные вирусом клетки-мишени, либо цитотоксические Т-лимфоциты при их контакте с такими клетками. При этом НК сами могут быть важными продуцентами интерферона в течение вирусной инфекции. В частности, показано, что при взаимодействии НК с вирусами гриппа или герпеса параллельно с продукцией IFN-б наблюдалось повышение активности НК, предполагая существование позитивной саморегуляции их функции интерфероном.

Увеличение активности натуральных киллеров при действии интерферона может осуществляться двумя путями. Интерферон может либо увеличивать активность существующих НК, либо стимулировать генерацию новой популяции НК путем активации дифференцировки предшественников НК в эффекторные клетки. Существующие данные позволяют предположить, что в действительности оба механизма могут иметь место (см., например, Bloom, 1980 ; Berman, Franfort, 1982 ).

Известно, что цитотоксичность, индуцируемая НК, не является антиген-специфичной и не ограничена по антигенам МНС. Поэтому повышение активности НК при действии интерферона не связано с повышением экспрессии на их поверхности антигенов гистосовместимости, как это имеет место при стимуляции макрофагов или цитотоксических Т-лимфоцитов. По всей вероятности молекулярные механизмы регуляции цитотоксической активности Нк и К-лимфоцитов, опосредованные интерфероном, связаны с повышением экспрессии рецепторов к Fc фрагменту иммуноглобулинов G (в случае К-лимфоцитов) и рецепторов к IL2 (в случае НК-клеток).

Во всяком случае для НК мыши и человека показано, что IFN- альфа/бета вызывал увеличение на их поверхности рецепторов к IL2. Эти данные показывают, что кроме интерферона в регуляции активности НК (и, возможно, К-лимфоцитов) могут принимать участие другие лимфокины, например, IL2. При этом процессы активации цитотоксичности могут быть связаны также с изменением внутриклеточного метаболизма этих макрофагов.

Таким образом, в течение вирусной инфекции активность НК и К-лимфоцитов может регулироваться индуцированным вирусом интерфероном. При этом секретируемый интерферон действует локально, вызывая активацию цитотоксических клеток, которые обеспечивают лизис инфицированных вирусом клеток, ограничивая распространение вируса в организме. НК активируются в ранний период инфекции после того, как начинает синтезироваться интерферон, а активированные К-лимфоциты вызывают избирательный лизис вирус-инфицированных клеток в поздний период после того, как появляются специфичные к вирусу антитела.

Метод позволяет не только определить количественное соотношение основных популяций лимфоцитов – истинные натуральные киллеры (NK-клетки) (CD3-CD56+CD45+), но и оценить малые клеточные популяции, а также изучить их функциональную активность: NK-клетки цитолитические (CD3-CD16+(orhigh) CD56dimCD45+), NK-клетки цитокинпродуцирующие (CD3-CD16-(orlow) CD56brightCD45+), NK-клетки, экспрессирующие альфа-цепь антигена CD8 (CD3-СD8+CD45+).

Материал для сдачи NKT-клеток (CD3+ CD56+), NK-клеток (CD56+ CD3-)